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    標志物LC3檢測時需要注意的5大要點

    提供者:武漢菲恩生物科技有限公司   發布時間:2023/11/7 10:13:03  閱讀次數:13次   進入該公司店鋪

    自噬(auhagy)是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年發現細胞內有“自己吃自己”的現象后提出的,是指從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體(auhagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內容物,以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。

    自噬

    自噬的功能

    1.饑餓應答時的作用,在不同的器官如肝臟或在培養細胞中,氨基酸的匱乏會誘導細胞產生自體吞噬,由自體吞噬分解大分子,產生在分解代謝和合成代謝過程中所必須的中間代謝物。

    2.在細胞正;顒又械淖饔,如在動物的變態發育、老化和分化過程中,自體吞噬負責降解正常的蛋白以重新組建細胞。盡管通常人們認為自體吞噬不具有選擇性,但是在某些病理和壓力條件下,通過自體吞噬能選擇性地隔離某些細胞器,如線粒體、過氧化物酶體等。

    3.在某些組織中的特定功能,如黑質的塞梅林神經節中,多巴胺能神經元中的神經黑色素的合成就需要把細胞質中的多巴胺醌用自噬囊泡包被隔離起來。

    自噬過程的LC3

    微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3, MAP1LC3),是Atg8在哺乳動物中的同源物。LC3/Atg8 被具有蛋白內切酶活性的Atg4在羧基端剪切,生成胞漿型 LC3-I。在自噬形成時,胞漿型LC3-I通過Atg7 和 Atg3(分別對應泛素激活酶E1和泛素結合酶E2)參與的類泛素樣反應,使磷脂酰乙醇胺 (PE) 偶聯,生成脂質化形式的 LC3,也稱作 LC3-II,它附著到自噬體(auhagosome)的膜上,是自噬體的結構蛋白,即自噬體膜型LC3-II。在降解過程中,位于自噬溶酶體外膜的LC3-II被半胱氨酸蛋白酶Atg4B切割,產生LC3-I循環利用;位于內膜的LC3-II則與包裹的內容物一起,被溶酶體降解。導致自噬溶酶體中LC3含量很低。

    自噬過程的LC3

    在哺乳動物中,存在 4 種LC3異構體(LC3A、LC3B、 LC3B2和 LC3C),在不同的組織細胞中表達會有差異。目主要研究的是LC3A和LC3B,LC3C在許多細胞中表達量很低,研究的也較少。其中每種異構體都可以有I和II兩種亞型。

    在進行自噬研究時,檢測 LC3-I 和 LC3-II 幾乎是必做的實驗,利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時,胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I,LC3-I跟PE結合轉變為(自噬體)膜型(即LC3-II),因此LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。那么,進行 LC3 檢測時,需要注意哪些要點呢?

    1.需要知道樣本的LC3表達量和表達的種類。不表達或者表達量很低樣本,就不適合用于自噬的研究。使用LC3A或LC3B的抗體均可,使用LC3A/B抗體,同時檢測兩種,可以大大提高實驗成功率。

    2.LC3-I 和 II 存在一個生成-降解的動態過程,所以單時間點 LC3-II 的表達改變并不能體現自噬的改變,需要使用一些阻斷溶酶體降解的藥物(如氯喹、巴佛洛霉素 A1 等),判斷在干預手段下,細胞的自噬程度的改變。氯喹可以通過抑制溶酶體功能(比如升高它的 pH 值),抑制 LC3-II 的降解;巴佛洛霉素 A1 則是一種強效 V-ATPase 抑制劑,阻斷溶酶體依賴的降解。在「堵漏」的提下,根據一段時間內 LC3-II 的積聚程度,判斷自噬的改變。

    3.目的 LC3 抗體所檢測的抗原表位都位于 LC3 的 N 端,由于 PE 基團結合可能導致 N 端區域的構象變化,使得抗體對 LC3-II 的親和性更高,所以 LC3-II 條帶顯色深并不能代表該樣本處于高自噬狀態。另外,LC3-I 對反復凍融更為敏感,也更易在 SDS 上樣緩沖液中降解;谝陨蟽蓚原因,在半定量時,除了使用 LC3-II/LC3-I 的比值外,也有科學家使用 LC3-II 與管家蛋白(Housekeeping Protein)的比值進行半定量。

    4.LC3是膜相關蛋白,在細胞裂解后,對其進行冰上短暫超聲,促進蛋白的溶解,將 LC3 從膜上解離。LC3-I 和 LC3-II 是小分子蛋白,雖然理論上LC3II分子量更大,由于帶負電的PE改變了LC3II的性質,使其疏水性更強,導致其在電泳中遷移率更高。所以,LC3II電泳后停留在更小分子量(約14kDa)。

    5.由于LC3-I 與 LC3-II 分子量小,又僅有 2 KD 差異,WB注意選用高濃度分離膠(約15%),轉膜使用0.22μm轉印膜,濕轉70V,1.5h或半干轉2.5A,7min。

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